Protocole Immunofluorescence (Cellules)
Préparation des lamelles
Lavages (en condition non stérile dans falcon de 50 ml))
- acétone pure
- eau distillée
- éthanol 70% (possibilité de consevation)
- eau distillé
Stérilisation (sous la hotte)
- étaler lamelles sur un papier whatman (sans qu'elles se superposent)
- exposer 20' aux UV
Fixation des cellules sur lamelles (possiblité de fixation méthanol 6’)
- aspirer milieu où se trouvent les coverslips couvertes de cellules.
- laver 2 fois les cellules en PBS 1x (dans la boite de 6 puits) (2ml)
possibilité de perméabilisation préalable pour évacuer la fraction cytosolique : a) incubation 1' maxi avec du PBS Triton 0,1% (jusqu'à 0,5%)
ou b) incubation 2’ maxi avec tampon PHEM à 37°C
- incuber 5' en paraformaldéhyde=PAF (3.7% dans PBS) à 37°C
- éliminer cette solution au pipetman sous la sorbonne
- perméabiliser 2 fois 5’ en PBS Triton 0.1% à 37°C
Possibilité d'arrêt de la manip' :
- ajouter une solution de PBS-Glycérol 50% (2ml)
(Vf=50 ml : 25 ml glycérol, 5 ml PBS 10x et 20 ml H2O) et conservation à -20°C mais jamais plus que sur la nuit. (laver 3x en PBS 1x avant la saturation)
Saturation
- Préparation solution de saturation : PBS 1x + BSA 10%
- Matériel :
Dans une boîte (chambre humide), déposer un papier whatman humidifié à l'eau
(ou alternativement, préparer la chambre humide en mettant du parafilm sur une paillasse et labeller tout autour)
- mettre une goutte de TBS 1X par coverslip sur le parafilm
- poser les coverslips dans la goutte de TBS, cellules vers le haut
- aspirer et laver en TBS 1X (surtout si les cellules ont été en PBS-Glycérol)
- incuber 45’ – 1 heure en solution de saturation en protégeant de la lumière. (Pendant ce tps, préparer solution Ac primaires dilués dans solution de saturation, à garder dans la glace)
Marquages
- déposer la solution d’anticorps primaires sur la lamelle placée sur le parafilm (coté cellules vers le haut). Compter 25 à 50µl de solution d’anticorps par lamelle.
- incubation primaire d'1 heure. Protéger de la lumière
- 3 lavages en TBS-Triton 0.1% de 5’ (Pendant ce temps, préparer solution Ac secondaires dilués dans solution de saturation dans la glace)
- incubation avec la solution d'anticorps secondaires pendant 45’. Protéger de la lumière
- 3 lavages en TBS-Triton 0.1% de 5’. (Pendant ce temps, préparer et annoter les lames)
Possibilité de faire un marquage DAPI – Incubation 1’
- 1 lavage TBS 1X (dans un bécher)
- 1 lavage en eau distillée (dans un bécher)
- éliminer le plus d'eau possible sur du papier whatman
- déposer chaque lamelle sur la goutte de MOWIOL ou autre agent de montage
- Sertir chaque lamelle avec du vernis
- laisser environ 10’à température ambiante en laissant la boîte entrouverte
Conserver à 4°C ou -20°C selon l’agent de montage et garder à l’abri de la lumière
PHEM:
KPIPES 45 mM, HePes 45 mM, EGTA 10 mM, MgCl2 5 mM, Leupeptine 1µg/ml, Pepstatine 1µg/ml, PMSF 1mM, Triton 0.5%
PAF 3.7%:
3.5ml ddH2O
1.85g paraformaldehyde
10µl KOH 10N
Plonger dans un bain à 95°C pendant 5 min jusqu’à ce que la solution devienne translucide (PAF complètement dissoute)
Filtrer à l’aide d’une seringue (solution à 37%)
Complèter à 45 ml avec du PBS 1X et 450µl de PBS 10X
Ajuster le pH à 6.8 (ajouter 5µl d’HCl au besoin)
Solution finale 3.7%